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长期被误解 非编码RNA存在“认知黑洞”

2018-05-09 14:20
来源:科技日报

本文地址://www.qdkdd.com.cn/kj/test/detail/20180509/1000200033136211525846817190740541_1.html
文章摘要:长期被误解 非编码RNA存在“认知黑洞”,人做人事不知公安交通,掩口葫芦邮差曲尺。

在人类基因组中95%的基因并不编码蛋白质,其他物种也有大量的非编码基因。这些DNA不会被编码成蛋白质,却又会转录出非编码RNA,它们对生命活动起什么作用?是进化的冗余还是神秘的缓存?

《细胞》杂志近日刊登中国工程院院士曹雪涛团队的研究论文,他们发现一种全新非编码RNA分子。该分子能够调控免疫系统的“进”与“退”,这是此前学术界从未认识和证明的。

“由于长链非编码RNA(lncRNA)丰度低,业界对其功能争议很大。”浙江大学生命科学研究院教授徐平龙在此前接受采访时评价道,但此次发表的研究严谨地鉴定了所发现的一种全新lncRNA是有功能的,即能够进行免疫调控,而曹雪涛院士正是这一机制的主要开拓者之一。

大海捞针 从浩淼细胞中层层筛选而出

细胞虽小,却瀚如乾坤。寻找一个不知道存不存在的RNA分子,如大海捞针。

到哪里找线索?病毒感染给了曹雪涛启示。谈到为什么会从病毒这个“敌人”的角度考虑。曹雪涛讲道:“我们中国文化讲,阴中有阳、阳中有阴,这是外国人很难理解的。这一哲理指导我们对免疫系统的理解就是,激活和抑制很可能会交融在一处,那么我们就从这个‘交融点’突破解题。”

既然体内蛋白能够识别外来的病毒RNA,能不能识别体内自身RNA呢?

科学界大部分认为不能。“免疫系统拥有识别‘自我’‘非我’的能力,就好像边境卫士,对外来的侵害反应敏感,对辖内‘居民’熟视无睹。”曹雪涛院士团队成员之一、中国医学科学院基础医学研究所教授姜明红说,“但是曹老师并不这么看,他说,究竟是不是熟视无睹,你要证明才行。”

在中国传统哲理思想的指引下,曹雪涛锁定了一个已知的关键蛋白——“RIG-I”,求证这个能与病毒RNA结合的蛋白,会不会和体内自身的RNA分子结合。

RIG-I很像一个分子水平的“老鼠夹子”,2011年有科学家解析了这个蛋白的分子结构,发现“老鼠(病毒RNA)”没来的时候,夹子合着,两头的结构域相互作用,蛋白处于“闭合”状态;一旦“老鼠”来了,与夹子的一头结合,另一头就会“弹开”,蛋白遂处于激活状态。而这样的构象变化,会引发细胞合成出关键的抗病毒分子——干扰素,干扰素分泌后被周围细胞接受,引发抗病毒的“连锁反应”。

研究团队通过紫外加强RNA结合蛋白免疫沉淀(UV-RIP)的方法,将“老鼠夹子”和它猎捕的“老鼠”同时从细胞中分离出来。随后通过蛋白质变性等方法,把“老鼠夹子”过滤掉,就获得与RIG-I结合的所有RNA。

夹子“钓”上来的所有RNA中,有没有未被发现的有功能的lncRNA呢?

将“捞针”的范围锁定夹子“钓”上来的RNA后,团队又通过设计对应的干扰实验继续缩小范围,即看究竟哪个RNA被封杀之后,免疫活动不再被抑制。功能筛选帮助团队锁定了一批备选者并列出“排名”。排名靠前的RNA分子,且与特定信号通路相关的lnc-Lsm3b被锁定,一个新的RNA分子从浩淼的小鼠巨噬细胞中经过层层筛选被“打捞”上来,并获得了确切的序列。

团队后续开展了多角度的证明工作,如通过干扰、敲除、过度表达等技术,反复证明lnc-Lsm3b能够在病毒感染的细胞中,通过“分子诱饵”的方式锁定RIG-I,使其不与病毒RNA结合。

海量实验 顶级期刊的尖锐难题被逐个攻克

全新的发现,使得团队兴奋异常。没想到的是,更大的磨砺还在后面。

团队向顶级期刊投稿,审稿人却要求必须用CLIP(交叉互连免疫沉淀)技术明确RNA的哪一个点和蛋白质相互作用,连接在一起。用语言很难解释蛋白质和RNA在活体细胞内错综复杂的关联,姜明红给科技日报记者画图:一个长链RNA会结合多个蛋白,这些蛋白有的是特异连接,连得紧密,有的就是“挂”在上面,而蛋白之外还会带上其他的RNA,“缠绕”“连带”“虚实”……

CLIP很难做,国内实验室极少有成熟的经验。收到修改意见后的团队成员开始大量查阅论文。“国外的实验流程无法完全照搬,不同的细胞做法不同,需要重新摸条件。”团队中主要攻关这一技术的刘伦说。

CLIP技术和RIP(RNA结合蛋白免疫沉淀)技术类似,但是却能够达到单个碱基的分辨率。为此,通过海量实验,针对裂解液的成分如何影响细胞内物质,团队开始了如指掌;不同RNA酶的脾气也熟练掌握。

“实验室的部分我们自己攻克了,但是测序公司表示无法进行匹配的测序工作,原因是无法合成特有的适当引物。”刘伦说,国内没有公司生产CLIP所需引物,而RNA测序必须先反转录为cDNA才能够进行,引物决定了反转录的准确性,决定了目标位点能否确定。实验室自己担负起RNA转录、构建cDNA文库的工作。完成3代测序、用化学方法测量分子间的相互作用力……这些免疫研究实验室原本并不擅长的难题被团队逐个攻克。

按图索骥 摸索并掌握一套独有技术体系

根据已有发现,团队按图索骥,利用分子筛层析实验证实缺失lnc-Lsm3b表达的巨噬细胞在感染病毒以后,多聚化的RIG-I蛋白显著增加。他们推测,病毒RNA与RIG-I结合以后,能够诱导RIG-I单体形成多聚化状态,从而激活下游信号通路。而lnc-Lsm3b只与单体结合,可能是通过抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。

“Lsm3b只能结合单体的RIG-I蛋白、一条链能结合9个蛋白、结合力比病毒RNA高……”这些都是对这个全新RNA分子的多角度了解。

如同向“黑洞”中打进一束光,牛牛网:曹雪涛团队在对现有知识体系颠覆的同时,肯定地回答了学界之前关于这类自身RNA分子是否存在、功能几何的争议。

“过去我们用别人的技术进行实验,现在我们自己摸索并掌握一套独有的技术。”曹雪涛说,整个研究的“练兵”不仅拓展了人类的“知识域”,还拓展了实验室的思路和眼界。接到《细胞》杂志编辑部发来修改要求时感受到的“不可思议”和巨大压力,团队成员现在已能笑谈。

“只是这段RNA与人类的同源性很低。”姜明红表示了小小的惋惜,这意味着,该发现无法直接应用于人类的新药创制领域,但是,其他拥有人源细胞材料的机构,可以沿着这条路,进一步发现人类机体内是否存在相似的RNA。曹雪涛更看重的是,确定靶点的方法一旦被高质量地掌握,就能够确定蛋白质的靶点,进而确定药物作用的靶点,助力抗病毒药物的研发。

责任编辑:常磊

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